DNS – Analyzer (Electrophorese) der Genetiker / Virologen 20-30% Fehlerrate Excel – ähnliche Datenblätter mit Genom Aufschlüsselung Quelle: //doi.org/10.1371/journal.pone.0088519.g002 nur im Resultat der Genom-Änderung = Erfolg erkennbar – durch z.B. Muskelwachstum Gefahr der Falschaussage bei neuartigen Objekten im atomaren Raum Kein offizielles Kontrollsystem vorhanden

3D Datensatz Elektron-Mikroskopie Fehler-Rate in %? falsche Bezeichnung des 3D Objektes Neuauswertung des gescannten 3D Objektes neue Funktionen erkennbar (vor allem wenn Objekte sich bewegen könnten-sind aber aktuell in Cryostase versetzt) Überprüfung aktueller Wissenschaft (bestätigen sich chemisch-physikalische Vorgänge?) Interaktion verschiedenster Objekte untereinander auf Zellebene bis auf subatomarer Ebene Bestätigen / Widerlegen verschiedenster Viren / Objekte so sollte ein Virus aussehen (eine innen-liegende RNS in ROT ist sichtbar): Quelle: //doi.org/10.1371/journal.pone.0088288.g006 Die "Viren" der hier aufgezeigten 3D Objekten auf Föderation.com hingegen sind hohl im Zentrum:

 

Desweiteren zählt folgende offene Fragestellung:

Die Definition eines Virus besteht durch seine Bestimmung über das Genom. Deswegen sind auf der Föderation.com abgebildeten Viren eventuell keine Viren.

Es wurde bisher kein COVID19 oder Masern Virus Datensatz der Elektronmikroskopie / Xray / normales Mikroskop gefunden!

Zusatz: zu dem obigen Influenza Virus mit inneliegenden Genom mit Bild hier die Studie:

Morphologie von Influenza B / Lee / 40, bestimmt durch Kryo-Elektronenmikroskopie

Abstrakt

Kryo-Elektronenmikroskopie-Projektionsbildanalyse und Tomographie werden verwendet, um die Gesamtarchitektur der Influenza B / Lee / 40 zu beschreiben. Algebraische Rekonstruktionstechniken unter Verwendung von Volumenelementen (Blobs) werden verwendet, um Tomogramme dieses pleomorphen Virus zu rekonstruieren und virale Oberflächenspitzen zu unterscheiden. Der Zweck dieser Forschung ist es, die Architektur von Influenza-Typ-B-Virionen durch Kryo-Elektronentomographie und Projektionsbildanalyse zu untersuchen. Ziel ist es, den Grad der Ribonukleoproteinstörung bei unregelmäßig geformten Virionen zu untersuchen. und um die Anzahl und Verteilung von Glykoprotein-Oberflächenspitzen (Hämagglutinin und Neuraminidase) auf Influenza B zu quantifizieren. Die Projektionsbildanalyse der Virionmorphologie zeigt, dass die Mehrheit (~ 83%) der Virionen sphärisch mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 134 ± 19 nm sind. Die asphärischen Virionen sind größer (durchschnittlicher Durchmesser = 155 ± 47 nm), zeigen eine Störung der Ribonukleoproteine ​​und zeigen einen teilweisen Verlust von Oberflächenproteinspitzen. Eine Zählung von Glykoproteinspitzen zeigt an, dass ein typisches Typ B-Virion mit 130 nm Durchmesser ~ 460 Oberflächenspitzen enthält. Die Konfiguration der Ribonukleoproteine ​​und Oberflächenglykoproteinspikes wird in Tomogrammrekonstruktionen sichtbar gemacht, und die EM-Dichten visualisieren die Ausdehnung der Spikes in die Matrix. Die Bedeutung der viralen Matrix für die Organisation der Virusstruktur durch Wechselwirkung mit den Ribonukleoproteinen und die Verankerung der Glykoproteinspikes an der Matrix wird demonstriert.

Zitat: Katz G., Benkarroum Y., Wei H., Rice W. J., Bucher D., Alimova A. et al. (2014) Morphologie von Influenza B / Lee / 40, bestimmt durch Kryo-Elektronenmikroskopie. PLoS ONE 9 (2): e88288. //doi.org/10.1371/journal.pone.0088288

Herausgeber: Paul Digard, Universität Edinburgh, Großbritannien

Eingegangen am 19. Juli 2013; Akzeptiert: 7. Januar 2014; Veröffentlicht: 6. Februar 2014

Copyright: © 2014 Katz et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License verbreitet wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion auf jedem Medium ermöglicht, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben sind.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde vom CUNY Collaborative Incentive Research Grant unterstützt. Forschungszentren der National Institutes of Health (NIH) in Minderheiteninstitutionen / CCNY Grant G12-RR03060; New York State Foundation für Wissenschaft, Technologie und Innovation (NYSTAR) Grant C000087; National Science Foundation (NSF) gewährt DMS-1114901; und Nationales Institut für Allgemeinmedizin Grant SC1-GM092781. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerfassung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Einführung

Die Influenzaviren gehören zur Familie der Orthomyxoviridae, von denen es drei verschiedene Typen gibt – A, B und C. Beide Typen A und B verursachen epidemische Erkrankungen und Typ A verursacht eine Pandemie. In einigen Jahren hat B eine höhere Prävalenz als A [1] [2]. Daher sind sowohl A (zwei Subtypen) als auch Typ B im dreiwertigen saisonalen Influenza-Impfstoff enthalten. Da zwei unterschiedliche antigene Abstammungslinien von B mit unterschiedlicher Inzidenz existieren, haben die Hersteller die Genehmigung erhalten, vierwertige Impfstoffe zu formulieren [2]. Aufgrund der Antigenvielfalt bei Influenzaviren müssen neue Impfstoffe jährlich neu formuliert werden. Influenza A und B enthalten beide segmentierte Genome, die aus 8 verschiedenen Ribonukleoprotein (RNP) -Elementen bestehen, die jeweils eine negative Sense-RNA enthalten [3]. Die Oberflächenglykoproteinantigene Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind beide signifikante Immunogene, die zur Entwicklung einer Anti-Influenza-Reaktion beitragen [4]. Neben dem Verständnis der grundlegenden Virusstruktur und der Eigenschaften dieser Viren wäre es für Impfstoffhersteller auch von Wert, die Menge und die relativen Mengen an HA und NA auf der Virionoberfläche von Wildtyp- und Impfstoffkandidaten zu bestimmen. Dies würde bei der Bestimmung des besten Kandidaten für eine maximale Antigenausbeute während der Impfstoffproduktion helfen. Darüber hinaus beeinflussen die Mengen und relativen Mengen von HA und NA die Wirksamkeit des Impfstoffs bei der Erzeugung einer immunogenen Reaktion. Die Form der Viruspartikel kann auch für die Produktion mit hoher Ausbeute von Bedeutung sein, da Stämme mit sphärischen Virionen bekanntermaßen einen höheren Titer in ovo produzieren als Stämme, die filamentös sind [5]. Sphärische Virionen können die biophysikalischen Eigenschaften aufweisen, die für eine optimale Reinigung des Virus während der Gradientenzentrifugationsschritte erforderlich sind, die während der Herstellung des Impfstoffs verwendet werden. Ruigrok et al. [6] fanden heraus, dass kugelförmige Influenzapartikel eine höhere Infektiosität und ein höheres Verhältnis von HA zu M-Protein aufweisen als nicht kugelförmige Virionen. Eine hohe HA-Spike-Menge ist eine wichtige Eigenschaft für eine effiziente Impfstoffproduktion.

Röntgenkristallographie hat die Atomstruktur von HA [7] – [10] und des NA-Kopfes [11] [12] gezeigt. HA sind Trimere mit einer verlängerten Fusionsdomäne, einer globulären Rezeptorbindungsdomäne und einer Vestigialesterasedomäne. NA sind keulenförmige Tetramere mit 4-strängigen antiparallelen β-Faltblättern, die wie die Blätter eines Propellers angeordnet sind [11] [12].

Influenza-Partikel sind pleomorph. Laborangepasste Stämme sind typischerweise kugelförmig mit Durchmessern im Bereich von 100 bis 130 nm, aber die Virionen können auch als größere Ellipsoide oder filamentöse Virionen vorliegen, die mehrere Mikrometer lang sein können [13] [14]. Da die Influenza pleomorph ist, ist eine 3-D-Strukturanalyse des gesamten Virions nicht durch Einzelpartikelanalyse oder Tomogrammmittelung möglich. Kryo-EM-Tomographie wurde eingesetzt, um die Oberflächenproteine ​​zu untersuchen. Harris et al. [15] visualisierten die 3-D-Struktur des H3N2-Stamm-X-31-Virus vom Typ A mithilfe der Kryo-EM-Tomographie und stellten fest, dass ein typisches Influenza-Virion vom Typ A mit 120 nm Durchmesser bis zu 375 Oberflächenspitzen enthalten kann, die tatsächliche Anzahl jedoch aufgrund viraler Oberflächenregionen mit geringerer Spikedichte niedriger sein. Calder et al. [14] verwendeten die Kryo-EM-Tomographie, um die strukturelle Organisation der filamentösen Influenza A zu untersuchen, und beobachteten, dass die Wechselwirkung zwischen dem M1-Protein und der umgebenden Hülle die Morphologie des Virions bestimmt. Giocondi et al. [16] verwendeten Rasterkraftmikroskopie, um die 3-D-Topographie der H1N1-Influenza zu untersuchen, und eine laterale Heterogenität der HA- und NA-Spikes wurde für Virionen bei neutralem pH und nach Behandlung bei pH 5 beobachtet. Die Verteilung von Oberflächenglykoproteinen auf zwei filamentösen Typen Kürzlich wurden Viruspartikel (A / Udorn / 72 und A / Aichi / 68 X-31) bestimmt [17].

Verbesserungen der Rekonstruktionsalgorithmen können zu einer besseren Identifizierung von Komponenten dieses nicht symmetrischen Virus führen. Marabini et al. [18], [19] zeigten, dass algebraische Rekonstruktionstechniken (ART) unter Verwendung verallgemeinerter Kaiser-Bessel-Fensterfunktionen (allgemein als Blobs bekannt) wirksamere 3D-Rekonstruktionen in der Elektronenmikroskopie ergaben als solche, die mit alternativen Methoden hergestellt wurden. Es wurde gezeigt, dass ART mit Blobs der gewichteten Rückprojektion überlegen und rechnerisch effizienter ist als simultane iterative Rekonstruktionstechniken (SIRT) [18] – [20]. ART sind iterative Verfahren zur Lösung linearer Gleichungs- oder Ungleichungssysteme, die zuerst von Kaczmarz [21] vorgeschlagen und von Gordon et al. In das biomedizinische Feld eingeführt wurden. [22]. Blobs sind sphärisch symmetrische Volumenelemente, die Voxeln für die Abschätzung der Formen biologischer Objekte überlegen sind und die Tatsache berücksichtigen, dass biologischen Elementen normalerweise senkrechte Kanten fehlen [18]. Blobs sind auch für Überlappungen verantwortlich, die glatte Übergänge erzeugen, eine Eigenschaft, die für die Rekonstruktion von Influenzavirionen mit der großen Anzahl von Oberflächenspitzen nützlich ist. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass ART eine angemessene Auflösung und Genauigkeit für die Differenzierung der HA- und NA-Oberflächenspitzen bietet.

In der vorgestellten Arbeit wird die Struktur von Influenza B / Lee / 40 durch Kryo-EM-Tomographie und Projektionsbildanalyse untersucht. B / Lee / 40 wurde in den 1940er Jahren als Influenza-Impfstoffkomponente verwendet und wird derzeit als Hochleistungs-Genspender zur Herstellung von Reassortant-Impfstoffkandidaten mit verbesserten Wachstumseigenschaften in Ovo verwendet [23].

Als erster Schritt bei der detaillierten morphologischen Klassifizierung des Influenzavirus Typ B / Lee / 40 wurden sowohl Projektionsbilder als auch durch ART mit Blobs der Viruspartikel rekonstruierte Tomogrammschnitte gesammelt und analysiert. Zusammen wurden sie verwendet, um die pleomorphen Formen von B / Lee / 40 zu charakterisieren; Bestimmen der Beziehungen der RNPs zur Form und Größe des Virus; und differenzieren die Oberflächen-Spike-Proteinelemente. Unser übergeordnetes Ziel in diesem Artikel ist es, die grundlegenden strukturellen und morphologischen Merkmale eines Typ-B-Virus zu identifizieren.

Es wird angemerkt, dass zwei Arten von Oberflächenspitzen, die in den gesammelten Bildern aufgelöst werden, den HA-Trimeren und NA-Tetrameren entsprechen. Zusätzlich sind die Beobachtungen hinsichtlich der Quantisierung des HA-Gehalts auf den Virusoberflächen der Influenzaviren Typ A und B von Bedeutung.
Materialen und Methoden
Virusvermehrung und -reinigung

Das B / Lee / 40-Influenzavirus wurde in embryonierten Hühnereiern gezüchtet und amplifiziert. Die ursprünglichen “Samen” -Allantoisflüssigkeiten, die Virionen vom Typ B enthielten, wurden 1 ~ 1000 in PBS verdünnt, das 250 & mgr; g / ml Gentamicin enthielt. Jedes Ei wurde mit 0,1 ml der verdünnten Allantoisflüssigkeit beimpft und 72 h bei 33 ° C inkubiert. Ein Stufengradient wurde verwendet, um die Viruspartikel auf ungefähr 1,6 mg / ml Protein-Gesamtvirusmasse zu reinigen [24]. Die Eier wurden am New York Medical College verwendet. Alle Arbeiten betrafen embryonierte Eier unter 12 Tagen und erfordern daher keine IACUC-Genehmigung. Embryonen wurden durch Unterkühlung eingeschläfert.
Kryo-Elektronenmikroskopie
Vorbereitung der Gitterprobe.

Drei µl einer Suspension einer Influenza B / Lee / 40-Probe wurden auf glimmentladene, perforierte Quantifoil-Gitter gegeben, geblottet und in flüssigem Ethan getaucht. Für einige Experimente wurde die Virusprobe mit einer Suspension von 10 nm Goldkügelchen vorgemischt, um Passermarken hinzuzufügen, um die tomographische Rekonstruktion zu unterstützen.

Tomografische Bildersammlung.

Für diese Studie wurden zwei Elektronenmikroskope verwendet. Vorläufige Bilder wurden bei 25000-facher Vergrößerung und einer Defokussierung von 8 ± 0,5 um unter Verwendung eines Tecnai F20-Elektronenmikroskops (FEI, Inc., Hillsboro, OR), das bei 200 kV auf einem TVIPS F415 4096 × 4096 CCD (Tietz Video and Image Processing) betrieben wurde, aufgenommen Systems GmbH Gauting Germany), zweifach (effektive Pixelgröße 8,8 Å / Pixel) unter Niedrigdosisbedingungen. Nachfolgende Bilder wurden mit einer 25000-fachen oder 50000-fachen Vergrößerung (4,4 bzw. 2,2 Å / Pixel vor dem Binning) und einem Unterfokus von 8 ± 0,5 um mit einem bei 300 arbeitenden JEOL 3200FSC-Elektronenmikroskop (JEOL, West Chester, PA) aufgenommen kV, was eine verbesserte Auflösung ergab. Ein Energiefilter mit einer Spaltbreite von 20 eV wurde eingesetzt, um nicht elastisch gestreute Elektronen zu eliminieren und dadurch den Kontrast zu verbessern. Tilt-Serien wurden unter Verwendung der SerialEM-Software [25] auf einer 4096 × 4096-Pixel-CCD-Kamera (Gatan Inc, Pleasanton, CA) aufgezeichnet. Die Probenwinkel lagen in 2 ° -Schritten zwischen ± 60 °. Der Bildgebungsmodus mit niedriger Dosis begrenzte die Gesamtdosis der Probe über die gesamte Neigungsserie auf 60 e / Å2. Insgesamt wurden 10 Neigungsserien mit 150 Virionen aufgenommen. Dreidimensionale Rekonstruktionen wurden an 3 isolierten Virionen durchgeführt, die ungefähr kugelförmig waren.
Tilt-Serie Bildverarbeitung.

Für Neigungsserien mit Passermarken wurde die tomografische Ausrichtung und Rekonstruktion mit der IMOD-Software durchgeführt [26]. Tilt-Serien ohne Passermarken wurden ausgerichtet und mit der Protomo-Software rekonstruiert [27]. Bei diesem Verfahren wird die Ausrichtung der ursprünglichen Projektionsbilder wiederholt, bis die relativen Bildverschiebungen weniger als 1 Pixel betragen und die geometrischen Korrekturfaktoren innerhalb von 1% liegen. Beide Pakete verwenden eine R-gewichtete Rückprojektion für die Ausrichtung der Neigungsserien bei der Rekonstruktion. Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung der Passermarken erzielt, und diese Rekonstruktionen wurden verwendet, um Virionzentren in 3D manuell zu identifizieren. Die Mittelkoordinaten wurden in die Neigungsreihe neu projiziert und dann verwendet, um kleinere Kastenneigungsreihen für einzelne Partikel herauszuschneiden. Nach der Rekonstruktion wurde der Kontrast durch Anwendung eines nichtlinearen anisotropen Diffusionsfilters [28] verbessert, das in der Bildverarbeitungssuite SPIDER [29] implementiert ist. Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass 60 Zyklen dieses Filters gute Ergebnisse liefern. Die Boxed Tilt-Serie wurde auch als Eingabe für die ART-Rekonstruktion in XMIPP verwendet [30]. Dreidimensionale Visualisierungen wurden unter Verwendung der Amira-Software (Visage Imaging, San Diego, CA) erzeugt.
Algebraische Rekonstruktionstechniken

Eine ausführliche Diskussion von ART findet sich in Kapitel 11 des Buches von Herman [31]. Kurz gesagt lautet die Idee wie folgt: Das zu rekonstruierende Virion wird durch eine Funktion (f (x, y, z)) dargestellt, die durch eine lineare Kombination einer endlichen Menge fester Basisfunktionen bj beschrieben wird, so dass. Die Aufgabe besteht darin, die unbekannten Koeffizienten aj basierend auf Projektionsbildern zu schätzen. Alle Pixel in allen Projektionsbildern werden durch die Ganzzahl i indiziert (1 ≤ i ≤ I, wobei I die Gesamtzahl der Pixel in den Projektionsbildern ist). Sei pi der Wert des i-ten Pixels; es ist ungefähr das Integral von f (x, y, z) entlang einer Linie, die auf die Mitte des i-ten Pixels projiziert. Da die Basisfunktion bj (x, y, z) bekannt ist (für 1 ≤ j ≤ J), ist es möglich, das Linienintegral ri, j der j-ten Basisfunktion entlang der i-ten Linie zu berechnen. Dies führt zu dem System von Näherungsgleichungen für 1 ≤ i ≤ I. Die verwendete Version von ART schätzt die Unbekannten aj wie folgt iterativ. Dem Anfangswert a0j wird typischerweise der Wert Null für 1 ≤ j ≤ J zugewiesen. Angenommen, die Werte akj der k-ten Iteration sind bekannt. Um die nächste Iteration zu erhalten, wird ein i ausgewählt (normalerweise durch wiederholtes Durchlaufen aller i in einer bestimmten Reihenfolge) und definiert durch: (1) wobei λ eine positive Zahl ist (ein typischer Wert für die Elektronentomographie wäre 0,05). Dass diese Methode für die tomographische Rekonstruktion von Virionen bei Verwendung von Blobs als bj wirksam ist, lässt sich an der Qualität der im Abschnitt Ergebnisse gezeigten Bilder ablesen.
Polardiagrammkorrelationen

Polardiagramme von zentralen Tomogrammschnitten wurden unter Verwendung der Chimera-Software in kartesische Koordinaten konvertiert [32]. Da die Virionen keine präzisen Kugeln sind, wurden zunächst schrittweise lineare Verschiebungen in radialer (y-) Richtung angewendet, um die äußere Membran in einem nahezu konstanten Radius auszurichten. Als nächstes wurden Segmente mit einer Dicke von zehn Reihen (~ 1,67 nm) gemittelt, um das Rauschen zu reduzieren. Der Korrelationskoeffizient Cjk zwischen den Segmenten rj und rk ist gegeben durch: (2) wobei i der Spaltenindex (x-Achse) ist, der zwischen dem Segment berechnet wurde, das den Köpfen der Proteinspitzen entspricht; und alle anderen Segmente bei Radien, die größer als die innere Grenze der Membran sind.

Resultate und Diskussionen

Morphologie und Größenverteilung

Die Untersuchung herkömmlicher Projektionsbilder von gefrorenen hydratisierten Influenza B / Lee / 40-Viren zeigt intakte Partikel, die jeweils von einer bestimmten Hülle umgeben sind, die die Oberflächenglykoproteinspikes HA und NA enthält. Die Partikel in diesen anfänglichen Projektionsbildern sind nicht einheitlich groß und einige hatten eine längliche Konfiguration, wie in Fig. 1 zu sehen ist. Bei den meisten Virionen ist die Peripherie gut definiert und besteht aus der äußeren Lipiddoppelschicht mit der darunter liegenden Matrix. Zusätzlich zu den vollständig zusammengesetzten Viren sind unvollständig zusammengesetzte Partikel erkennbar. Den unvollständig zusammengesetzten Virionen fehlen häufig die Oberflächenproteine ​​und sie bestehen hauptsächlich aus der Lipidhülle (siehe Insert in Abb. 1). Eine Untergruppe von Projektionsbildern mit 460 intakten Virionen wurde für die Größenanalyse ausgewählt. Viriongrößenmessungen wurden unter Verwendung von Projektionsbildern durchgeführt, da Viriondurchmesser aus der Projektionsbildanalyse genauso genau bestimmt werden können wie aus Tomogrammen und eine viel größere Probengröße effizient analysiert werden kann. Virionen, denen Oberflächenproteine ​​fehlen oder die defekt erscheinen, wurden von der Größenanalyse ausgeschlossen. Es wurde festgestellt, dass der durchschnittliche Viriondurchmesser 137 ± 27 nm beträgt. Die Größenverteilung ist in Fig. 2 (A) gezeigt. Von den intakten Virionen erscheinen 83% (383 von 460 Virionen) in Projektionsbildern ungefähr kreisförmig – was auf kugelförmige Partikel hinweist. Die anderen 17% der intakten Virionen (77 von 460 Virionen) haben eine unregelmäßige Form. Die unregelmäßigen Virionen sind durchschnittlich 16% größer (155 ± 47 nm) als die sphärischen Virionen (134 ± 19 nm). Die unregelmäßigen Virionen zeigen eine größere Größenvariation (siehe 2 (B)) als sphärische Virionen, wobei 10 von 77 unregelmäßig geformten Virionen (13%) mehr als 2 Standardabweichungen größer als der Mittelwert sind, verglichen mit 10 von 383 (3) %) von kugelförmigen Virionen. Für unregelmäßig geformte Virionen wird angenommen, dass die Größe die längste lineare Dimension einschließlich der Oberflächenglykoproteine ​​ist; Für ungefähr kugelförmige Virionen ist die Größe der Viriondurchmesser einschließlich der Oberflächenglykoproteine.

Abbildung 1. Projektionsbild von gefrorenen hydratisierten Influenza B-Virionen.

Oberflächenspitzen sind in allen Partikeln mit intakter oder teilweise intakter Matrix sichtbar. Ein defektes Virion, dem Oberflächenproteine fehlen, ist unten rechts identifiziert und im Einschub vergrößert.
//doi.org/10.1371/journal.pone.0088288.g001

Abbildung 2. Virion-Größenverteilung.

A) Histogramm des Viriondurchmessers. B) Streudiagramm des Viriondurchmessers; horizontale Linien sind Mittelwert und Mittelwert ± 1 Standardabweichung.
//doi.org/10.1371/journal.pone.0088288.g002

Um die morphologische Variation hervorzuheben, sind ausgewählte einzelne Virionen in den Fig. 1 und 2 gezeigt. 3A – C mit einer Kugel mittlerer Größe in Fig. 3A, einer Kugel größerer Größe in Fig. 3B und einem intakten Virion unregelmäßiger Form in Fig. 3C. Bei 50000-facher Vergrößerung sind die Glykoproteinspitzen klar aufgelöst. Die Spikes erstrecken sich in Übereinstimmung mit den angegebenen Messungen für Influenza Typ A 14,5 ± 1,3 nm über die Virionmembran hinaus [33]. Innerhalb der vollständig zusammengesetzten Partikel erscheinen die RNPs in den Projektionsbildern mit einer granularen Konsistenz, werden jedoch bei Tomogrammrekonstruktionen in einzelne Segmente aufgelöst (siehe Abschnitt Kryo-EM-Tomographie). Die unregelmäßige Virionprojektion (Fig. 3C) zeigt mehrere Regionen niedriger Dichte, denen möglicherweise die RNP-Dichte fehlt, während die regelmäßig geformten Virionen eine Konsistenz der inneren Dichte zeigen. Die Unterschiede in der RNP-Dichteverteilung zwischen den regelmäßig und unregelmäßig geformten Virionen können auf das Vorhandensein einer Assoziation zwischen der Membran und der RNP-Struktur hinweisen.

Abbildung 3. Projektionsbilder von drei Virionen.

A) sphärisches Virion mittlerer Größe; B) großes kugelförmiges Virion; und C) unregelmäßiges Virion. Das unregelmäßige Virion zeigt eine beträchtliche Störung in den RNPs, die durch Regionen niedriger Dichte angezeigt werden.
//doi.org/10.1371/journal.pone.0088288.g003

Schätzung des Glykoproteinabstands aus Projektionsbildern

In dem in Fig. 3A gezeigten Virion mit einem Durchmesser von 100 nm (130 nm einschließlich der Oberflächenspitzen) sind ungefähr 40 Spitzen sichtbar. Wenn die Überlappungseffekte von der Analyse ausgeschlossen werden, beträgt der durchschnittliche Abstand zwischen Proteinspikes 7,9 nm. Unter der Annahme, dass jede Spitze eine Fläche von (7,9) 2 nm2 einnimmt, passen ungefähr 500 Gesamtspitzen auf ein 130-nm-Virion [Oberfläche der Hülle beträgt 4π ((130–29) / 2) 2 = 3,2 × 104 nm2]. Diese Schätzung ist geringfügig höher als die von Harris et al. [15] (~ 375 Glykoprotein-Spikes auf einem 120-nm-Virion), stimmt jedoch besser mit den 530 Spikes überein, die Booy et al. Für Typ B / Hongkong berichteten. [34]. Booys Berechnungen stammten ebenfalls aus Projektionsbildern und das Problem der Überlappung wurde ignoriert. Die Anzahl der Oberflächenspitzen auf einer zentralen Tomogrammscheibe eines gleich großen B / Lee / 40-Virions beträgt 38, was einen durchschnittlichen Spike-Abstand von ~ 8 nm und damit insgesamt ungefähr 400 Spikes impliziert; Dies zeigt an, dass der Spike-Count-Fehler aufgrund der Überlappung in Projektionsbildern etwa 10% beträgt und ein typisches Virion mit 130 nm Durchmesser ∼ 460 Oberflächenglykoproteine ​​enthält. Die schlechtere Auflösung der Z-Achse der Tomographie kann jedoch zu einer zusätzlichen Unterschätzung der Überlappung führen.
Die Kryo-EM-Tomographie zeigt strukturelle Elemente des Virions

Die Kryo-Elektronentomographie wurde verwendet, um die Beziehungen zwischen den Virion-Elementen zu visualisieren. In den 7 Å dicken Abschnitten sind diskrete RNP-Segmente erkennbar; die virale Matrix ist gut abgegrenzt; und die von der Membranoberfläche herausragenden Spitzenvorsprünge lassen auf die tetrameren (NA) und trimeren (HA) Elemente schließen. Die IMOD R-gewichteten Rückprojektionstomogramme zeigen drei einzigartige morphologische Konfigurationen, wie sie in den in den Fig. 1 und 2 gezeigten zentralen Schnitten beobachtet werden können. 4 (A – C). Die drei Konfigurationen stimmen mit den Projektionsbildbeobachtungen überein. Das Virion in Fig. 4A mit nahezu sphärischer Morphologie zeigt eine ausgeprägte Organisation von RNPs, die typisch für die rekonstruierten Tomogramme sphärischer Partikel ist. Die nahezu kugelförmige Konfiguration ist am häufigsten anzutreffen, da die RNP-Segmente fast das gesamte Volumen des Partikelinneren einnehmen. Die zweite Konfiguration bestand aus länglichen Virionen (Fig. 4B). Diese enthielten eine gut definierte Hüllkurvenmatrixschicht, die vollständig von den Spitzen bedeckt war, jedoch weisen die RNPs eine gewisse Störung auf. Die dritte Konfiguration besteht aus größeren und stark unregelmäßig geformten Virionen (Fig. 4C). Die RNP-Segmente zeigten wenig Ordnung mit großen freien Flächen. Dies ist charakteristisch für die unregelmäßigen Virionen.

Abbildung 4. Morphologische Klassen von B / Lee / 40-Virionen.

Mit IMOD unter Verwendung von R-gewichteten Rückprojektionen erstellte zentrale Tomogrammschnitte: A) sphärisches Virion mit gut geordneten RNPs; B) längliches Virion mit einer RNP-Störung; und C) unregelmäßig geformtes Virion mit geringer RNP-Ordnung und einer großen Region, die eine sehr geringe Dichte von RNP zeigt (links unten vom Virion).
//doi.org/10.1371/journal.pone.0088288.g004

Mittelteil-Tomogramm-ART-Schnitte sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt. 5A – E für ein Virion mit 125 nm Durchmesser. Die fünf Schichten haben einen vertikalen Abstand (z-Achse) von 9 nm. Die Schnitte zeigen deutlich 14 nm lange deutliche Oberflächenspitzen, eine 8 nm dicke Hüllmatrix und diskrete RNPs innerhalb des Virions. Das Eindringen von Oberflächenproteinen in die Matrix wird aufgelöst und eine genaue visuelle Untersuchung zeigt zwei unterschiedliche Oberflächenproteinmorphologien: (1) nahezu gleichmäßige Dichte und Dicke; und (2) “clubartig” und mit einem dichteren Oberteil versehen. Das zweilappige HA-Trimer unterscheidet sich vom Club-ähnlichen NA-Tetramer mit angemessener Genauigkeit durch Auswertung der Konturspitzendichte in der Tomogrammscheibe. Ein Band-Rendering von 3-D-Atommodellen von HA (gelb) und NA (rot) (PDB-Einträge 2RFT bzw. 1BJI) [35] [36] wird unter Verwendung von Chimären in die Proteinoberflächenspitzen angedockt und in 5B gezeigt . Die Entsprechung des angedockten Bandes mit der EM-Dichte bestätigt die Identifizierung dieser Spiketypen. Die zentrale Schicht in Fig. 5B enthält 9 NA und 33 HA, was 120 NA und 441 HA für insgesamt 561 Glykoproteinspitzen auf der Oberfläche anzeigt. Die Ausrichtung der RNPs ist in den Tomogrammschnitten ersichtlich. Die RNPs scheinen Kontakt mit der inneren Matrix aufzunehmen und können mit dieser interagieren. Da die größeren, unregelmäßig geformten Virionen interne freie Bereiche aufweisen, deutet dies darauf hin, dass das Unterbrechen des Kontakts zwischen der inneren Matrix und den RNPs die gesamte RNP-Konfiguration stört. Harris et al. [15] berichtet, dass bei Influenza Typ A die RNP-Segmente auch an diskreten Punkten mit der inneren Matrix in Kontakt stehen. Es ist denkbar, dass die erweiterte Matrix des atypisch großen Virions eine RNP-Bindungsstelle stört, was zu einer erhöhten RNP-Störung führt. Die Tomogramme vom Typ B zeigen nicht die 7 plus 1-Konfiguration für RNP-Segmente, wie sie für Typ A während des Knospens angegeben wurde [15] [37]. Die großen unregelmäßigen Partikel zeigen trotz der Gesamtstörung eine gewisse Clusterbildung des RNP, was darauf hindeutet, dass die RNP-Segmente möglicherweise eine gewisse Bindung aneinander aufweisen. Fig. 6A zeigt eine Amira-Darstellung des Virions (in Fig. 5 gezeigte Scheiben) mit den in Fig. 6B gezeigten isolierten RNPs. Die RNP-Orientierungen variieren über die verschiedenen Tomogrammschnitte (Fig. 5), was eine verdrillte Konformation impliziert, die in Fig. 6B beobachtet wird.

Abbildung 5. ART-Rekonstruktion von B / Lee / 40.

A – E) Tomogrammschnitte im Abstand von 9 nm zur z-Achse. Angedockte Atommodelle von HA (gelb) und NA (rot) sind in Feld B dargestellt. RNPs sind blau umrandet.

//doi.org/10.1371/journal.pone.0088288.g005

Abbildung 6. Amira-Rendering der RNPs nach Segmentauswahl.

A) Vollständiges Virion. B) RNP-Elemente, die ausschließlich die verdrehte Bestätigung zeigen.

//doi.org/10.1371/journal.pone.0088288.g006

Fig. 7A zeigt eine zentrale Tomogrammscheibe eines typischen sphärischen Virions. Fig. 7B zeigt die Polarkurve (auf kartesische Koordinaten abgebildet) der Schicht in 7A. Obwohl ein Polardiagramm Artefakte bei kleinen Radien (r <25 nm) einführt, erleichtert die kartesische Karte Vergleiche der Dichteschwankungen in der Matrix zwischen größeren radialen Bereichen (HA- und NA-Spitzen) und radialen Bereichen im mittleren Bereich (RNP – Matrixkontaktpunkte). . Die Matrix ist das Band mit hoher Dichte, das sich von 40 nm bis 48 nm vom Zentrum entfernt befindet und ~ 8 nm dick ist. In Fig. 7B kann man Bereiche mit höherer Dichte im äußeren Abschnitt der Matrix unmittelbar unterhalb der Glykoproteinspitzen (r = 45 bis 48 nm) beobachten, was anzeigt, dass die Spitzen in die Matrix hineinragen. Einige der Bereiche mit höherer Dichte, die die Oberflächenspitzenverlängerungen anzeigen, sind in Fig. 7B durch schwarze Pfeile angegeben. Unterhalb der inneren Oberfläche der Matrix befindet sich ein Band niedriger Dichte mit mehreren Bereichen höherer Dichte, die durch weiße Pfeile in den Fig. 1 und 2 angezeigt werden. 7A und 7B. Diese Bereiche mit höherer Dichte innerhalb des inneren Bereichs der Matrix sind wahrscheinlich Orte, an denen die RNPs mit der Matrix verbunden sind. Die Korrelation von Dichten bei r = 57,6 nm (nahe den Oberflächenspitzenköpfen) mit Dichten bei anderen radialen Abständen ist in Fig. 7C aufgetragen. Wie erwartet besteht eine hohe Korrelation bei Radien nahe den Oberflächenspitzenköpfen (55 nm ≤ r ≤ 60 nm). Die Korrelation ist schwach (<0,2) bei Radien, die der Membran entsprechen (r ~ 48 nm), teilweise aufgrund der Lipide niedrigerer Dichte. Die Korrelation nimmt bei radialen Abständen zu, die der Matrix entsprechen (40 nm ≤ r ≤ 46 nm), was die beobachteten Ausdehnungen von Proteinspikes in die Matrix bestätigt.

Abbildung 7. RNP-, HA- und NA-Verbindungen in die Hüllkurve.

A) Zentrale Tomogrammscheibe; B) Polardiagramm der in Tafel A gezeigten zentralen Schicht, schwarze Pfeile zeigen Glykoproteinverlängerungen in der Matrix und weiße Pfeile zeigen Kontaktpunkte zwischen RNPs und Matrix. 0 ° in Feld B entspricht der –x-Richtung in Feld A und der Winkel nimmt gegen den Uhrzeigersinn zu. Bilder werden invertiert, d. H. Bereiche mit höherer Dichte sind heller. C) Korrelation der Dichten der äußeren Hüllenspitzen mit ihren Projektionen in die Matrix.
//doi.org/10.1371/journal.pone.0088288.g007

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend wurde die Gesamtmorphologie der B-Viruspartikel nach EM klassifiziert. Es wird gezeigt, dass eine Kombination von zwei Kryo-EM-Techniken: (1) Analyse von Projektionsbildern und (2) tomographische Rekonstruktion die Visualisierung eines B \ Lee \ 40-Virus mit pleomorpher Geometrie ermöglicht. Die Virion-Strukturelemente werden aufgelöst und ihre Wechselbeziehungen aufgedeckt. Die Matrix interagiert sowohl mit den Oberflächenglykoproteinen als auch mit den RNPs; und kann für die Organisation der gesamten Virusstruktur verantwortlich sein. Das HA-Trimer und das NA-Tetramer wurden in den Tomogrammen unter Verwendung von ART mit Blobs-Rekonstruktionen unterschieden. Die Identifizierung und Schätzung der Anzahl von Influenza-Oberflächenspitzen ist ein wertvoller Parameter bei der Auswahl nützlicher B-Virusstämme für die erfolgreiche Herstellung von Impfstoffen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von Blobs vielversprechend für die hohe Auflösung und Differenzierung der beiden Oberflächenspitzen ist. Dies ist das erste Mal, dass eine Tomogramm-3D-Analyse mit Blobs eingesetzt wurde, um die Oberflächenmerkmale des Influenzaglykoproteins im Kontext aufzulösen.
Danksagung

Die Autoren bedanken sich für die Vorbereitung der Viren durch Jianhua Le, Shiroh Onodera, Barbara A. Pokorny und Jeanmarie Silverman. Die Autoren sind auch dankbar für die hilfreichen Kommentare von Shiroh Onodera bei der Erstellung des Manuskripts.
Autorenbeiträge

Konzeption und Gestaltung der Experimente: DB AK GTH PG. Experimente durchgeführt: HW AA WJR. Analysierte die Daten: GK YB WJR AK JK GTH PG. Mitgelieferte Reagenzien / Materialien / Analysewerkzeuge: WJR DB. Schrieb das Papier: AK PG GTH DB.